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            2023-01-301553 次瀏覽
            酶聯免疫吸附劑測定

            定義:

            酶聯免疫吸附測定(簡寫ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。

            常用的ELISA可以分為五大類:直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA、競爭抑制ELISA。其他的ELISA都由這五類組合衍生。

            所有的ELISA基本由基礎的幾個步驟組合而成:將抗原或抗體吸附到固相載體上;加入待檢樣品以及后續試劑;溫育;洗滌去掉游離未結合的反應物;加入酶檢測底物;結果的判讀

             

            分類:

            1.直接ELISA

            將抗原按一定的比例稀釋,包被到固相載體上,加入稀釋好的特異性的酶標抗體,孵育后加入底物顯色并判讀結果。直接ELISA中只經過了一步信號放大,所以其靈敏度不是很高

             

            2.間接ELISA

            間接ELISA與直接ELISA不同的是,與包被好的抗原結合的是非酶標抗體,另外再引入第二種抗體(即二抗)。二抗是經過酶標的,它可以與第一種抗體特異性結合,最后加入底物顯色并判讀結果。在檢測抗體的效價、血清的效價以及單克隆抗體的篩選過程中,間接ELISA都是非常重要的實驗過程。

             

            3.夾心ELISA

            3.1直接夾心ELISA

            3.1.1雙抗體夾心ELISA           

            將第一種抗體(捕獲抗體)包被在固相載體上,封閉后加入待檢抗原,溫育后加入第二種抗體(檢測抗體),捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗,也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗,但是檢測抗體需要經過酶標。

            3.1.2雙抗原夾心ELISA

            原理和操作與雙抗體夾心ELISA基本相同,不同的是包被的是抗原,待檢對象是抗體,然后加入酶標抗原,再加底物顯色。雙抗原夾心ELISA利用特異性的抗原代替酶標二抗,所以特異性比間接法更好。另外,由于間接ELISA中使用的二抗一般只能識別IgG,而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測出,因此,雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。

            3.2間接夾心ELISA

            間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA,其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上(作為捕獲抗體),封閉,加入待檢抗原,溫育,洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體(非酶標,作為檢測抗體),最后加入酶標二抗(特異性識別檢測抗體),再加底物顯色。與直接雙抗夾心ELISA相比,其中引入了特異性識別檢測抗體的酶標二抗,相當于整個體系的信號增加了一步放大系統,最終的結果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。

             

            4.競爭ELISA

            將特異性抗體吸附于固相載體表面,經洗滌后分成兩組:一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液;而另一組只加酶標記抗原,再經孵育洗滌后加底物顯色,這兩組底物降解量之差,即為所要測定的未知抗原的量。這種方法所測定的抗原只要有一個結合部位即可,因此,對小分子抗原如激素和藥物之類的測定常用此法。

             

            5.競爭抑制ELISA

            預先將抗原包被在固相載體上,實驗時加入稀釋好的待檢抗原(或抗體),然后依次加入特異性的抗體以及此抗體對應的酶標二抗。待檢標本中的抗原(或抗體)就和預制備體系中固相載體上結合的抗原(或抗體)競爭結合特異性的抗體(或固相載體上結合的抗原)。洗掉被競爭的特異性抗體,最后加底物顯色。最終顯色的結果與待檢抗原(或抗體)量呈反比。

             

            實驗材料:

            96孔高吸附酶標板[NEST]           

            10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]

            單通道移液槍、多通道移液槍       

            微量離心管[NEST]

            顯色液(A/B液)                 

            15/50ml離心管[NEST]

            洗液(PBST                    

            終止液(H2SO4

            BSA蛋白                          

            稀釋液(PBS

            包被液(CB                     

            全波段酶標儀

            恒溫箱

             

            實驗流程:

            以使用比較廣泛的間接ELISA為例,簡述實驗過程

            1.抗原包被:

            將對應抗原用CB稀釋至1ug/ml,加入96孔酶標板孔中,每孔100ul,4℃包被過夜,之后進行下一步驟。若實驗時間比較緊張,包被后可放置恒溫箱內,37℃包被3h后即可進行下一步操作。

            2.洗板:

            將酶標板內的包被液甩干,用洗液(PBST——0.2%的吐溫20 PBS)清洗酶標板2次,并拍干板內液體,使之無余液殘留。

            3.封閉:

            PBS充分溶解BSA蛋白制備成封閉液(體積比為5~10%),將封閉液加入酶標板孔中,每孔150ul,恒溫箱37℃封閉1h。若實驗時間安排充裕,可在4℃條件下封閉過夜。

            【若抗原內含有偶聯BSA分子,則更換封閉成分,可用羊血清代替】

            4.洗板:

            將酶標板內的封閉液液甩干,用洗液(PBST)清洗酶標板2次,并拍干板內液體,使之無余液殘留。

            【若暫無使用需求,可將包被后的酶標板放置-20℃條件下儲存,需要時解凍使用即可?!?span lang="EN-US">

            5.一抗:

            PBS稀釋液將待檢樣品(含有對應抗原的抗體)按需求稀釋,再將稀釋后樣本加入包被好的酶標板中,每孔100ul,陰性對照孔加入100ulPBS稀釋液,在恒溫箱中37℃孵育1h。

            6.洗板:

            將酶標板內的一抗甩干,用洗液(PBST)清洗酶標板3次,并拍干板內液體,使之無余液殘留。

            7.二抗:

            PBS稀釋液按照說明,稀釋對應的酶標二抗,將稀釋完成的二抗加入一抗孵育完成的酶標板中,每孔100ul,恒溫箱37℃孵育30min。

            8.洗板:

            將酶標板內的二抗甩干,用洗液(PBST)清洗酶標板4次,并拍干板內液體,使之無余液殘留。

            9.顯色:

            將顯色液A/B液等體積混合,配置成顯色液,加入二抗孵育完成的酶標板中,每孔100ul,恒溫箱避光37℃反應5~10min。

            【顯色液現配現用,不可提前配置】

            10.終止與讀數:

            顯色完成后,無須丟棄顯色液,直接加入終止液(H2SO4)終止反應,每孔50ul,隨即轉移至全波段酶標儀450nm單波長度數,或450nm/620nm雙波長讀數,讀書完成后處理數據。

             

            使用到的NEST產品:

            96孔高吸附酶標板[NEST]           

            10μL/200μL/1000μL吸頭[NEST]

            微量離心管[NEST]                 

            15/50ml離心管[NEST]

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