<menuitem id="0j3o9"><tr id="0j3o9"></tr></menuitem>
    <menuitem id="0j3o9"><tr id="0j3o9"></tr></menuitem>
    <delect id="0j3o9"><pre id="0j3o9"></pre></delect>
            購物車(
            清空購物車
            2023-01-121648 次瀏覽
            小鼠單克隆抗體雜交瘤細胞定株簡要流程

            實驗材料:

            DMEM高糖培養基                     

            FBS/NBS                            

            HT選擇培養基                       

            CO2細胞培養箱

            細胞計數器                         

            單通道移液槍、多通道移液槍

            相差顯微鏡                         

            生物安全柜

            10μL、200μL、1000μL吸頭 

            96/24/6孔細胞培養板       

            15mL、50mL無菌離心管       

            100mm細胞培養皿           

            T75細胞培養瓶             

            96孔酶標板                

             

            實驗準備:

            陽性對照:

            融合前采對應實驗的小鼠眼球血,37℃放置2h,然后4℃放置2h,最后10000rpm離心10min,取上清,-20℃條件下保存。(使用前提前解凍,稀釋1000倍備用)

            陰性對照:

            各個階段培養基留5ml左右,作為陰性對照用。

            Elisa檢測板準備:

            將對應抗原用CB1μg/ml濃度加入96孔酶標板內(100μl/孔),4℃過夜靜置包被。用1×PBST洗板2遍,清洗結束,加入封閉液封閉,37℃封閉1h,用1×PBST洗板2遍,拍干水分,4℃短期保存,-20℃長期保存。

             

            實驗流程:

            融合檢測

            細胞融合換液后,等4~7天,觀察細胞融合狀態,大部分細胞培養孔內出現小細胞團,即可開始檢測。

            用排槍取融合培養上清100μL/孔至包被好的Elisa檢測板中,因為Elisa檢測板來源于外部,切記從細胞培養板中單次取液,不可反復吸取,取一次液換一次槍頭,防止污染細胞培養板內細胞,以及交叉污染影響檢測結果。(每塊板預留一孔陽性對照孔,一孔陰性培養基對照孔)

            根據陰性對照和陽性對照的OD值,確定陽性孔,取陽性對照OD值得一半以上的數值為陽性。

             

            第一次亞克?。?/span>

            根據融合檢測的數據,挑選陽性孔,將陽性孔中的細胞轉移至24孔板中培養擴增,根據細胞生長情況2~3天后采用Elisa方法復檢,防止假陽性。

            挑選24孔板中復檢陽性的孔,進行細胞復懸,使細胞在培養基中分散均勻。用細胞計數板進行計數,計數完成后,根據計數情況比例稀釋細胞懸液,按照1/孔的密度均勻鋪于96孔細胞培養板中,一個陽性克隆株鋪一塊細胞培養板板。[一次亞克隆采用FBS-DMEM(HT),培養基的血清使用濃度略低于融合時的濃度,略高于SP2/0常規培養濃度,可按照5% 進行區分]

             

            畫克?。?span lang="EN-US">

            一次亞克隆后,融合細胞在CO2培養箱中培養4~5天后,采用相差顯微鏡逐孔觀察,在單孔內有且只有一個正圓形細胞團的孔,即為單克隆細胞孔,做好標記。若無無單克隆孔,則挑選細胞團較少的多克隆細胞孔,做好標記。

             

            一次亞克隆檢測:

            畫克隆后,繼續培養3~5天,根據細胞生長情況,采用Elisa法進行一次亞克隆檢測,優選挑選陽性單克隆孔,若無陽性單克隆孔,則挑選克隆數較少的陽性多克隆孔。挑選出來的細胞株轉移至24孔擴增培養,進行陽性克隆株復篩,確保挑選的細胞株非假陽性。

             

            二次亞克?。?span lang="EN-US">

            將一次亞克隆挑選出來的細胞株,重復一次亞克隆步驟。細胞培養基換成FBS-DMEM,培養基的血清使用濃度調整成SP2/0的常規培養濃度。

             

            畫克隆

            二次亞克隆后4~5天,進行畫克隆,單克隆孔做好標記。

             

            二次亞克隆檢測:

            畫克隆后,繼續培養3~5天,重復一次亞克隆檢測步驟,挑選陽性單克隆細胞株,準備進行擴增培養。

             

            建株:

            陽性單克隆細胞株需進行至少2次的亞克隆,檢測為全陽方可建株!若為了保證穩定性,建議進行第三次亞克隆。

            挑出兩次檢測均為單克隆且全為陽性后,在24孔板中培養擴增,2~3天后用Elisa法進行交叉檢測(主要針對帶標簽的蛋白抗原)和穩定性鑒定。

            檢測合格后挑選一個細胞狀態,長勢較好且陽性OD值較高的細胞株,轉移至6孔板進行培養擴增,2~3天后,用亞型檢測試劑盒進行抗體亞型鑒定。

            完成以上鑒定后,將單克隆細胞株轉移至100m細胞培養皿或者T75細胞培養瓶中進行大量擴增。

            擴增完成后將單克隆細胞株進行細胞凍存,標記好細胞名稱、凍存者、凍存日期等信息,放置凍存盒中,轉移到-80℃冰箱,一天后轉移至液氮罐中儲存。

            凍存后一周再復蘇檢測,防止細胞株出現產抗不穩定現象,若檢測沒有問題,則將細胞株錄入細胞庫中,并撰寫實驗報告。(細胞凍存3/株,且3支確保有2個及以上凍存批次,避免出現凍存失誤,細胞株丟失)

             

            使用到的NEST產品:

            10μL、200μL、1000μL吸頭 

            96/24/6孔細胞培養板        

            15mL、50mL無菌離心管      

            100mm細胞培養皿            

            T75細胞培養瓶              

            96孔酶標板                

             

            一一本无码中文字幕_少妇一区二区视频_国产成人精品一 二区_一本二本人妻高清无码
              <menuitem id="0j3o9"><tr id="0j3o9"></tr></menuitem>
              <menuitem id="0j3o9"><tr id="0j3o9"></tr></menuitem>
              <delect id="0j3o9"><pre id="0j3o9"></pre></delect>